Evaluación de la capacidad antioxidante de harina de frambuesas obtenida luego del secado de los frutos a diferentes temperaturas y análisis estadístico del EC50

 

Los frutos peque?os constituyen una buena fuente de sustancias naturales antioxidantes. Los extractos de frutos de diferentes cultivos de zarzamora, frambuesa y grosella espinosa actúan efectivamente como inhibidores de radicales libres (Heinonen, Meyer, 1998). Además, se ha investigado el contenido de fenol, antocianina y ácido ascórbico (Prior et al, 1999). Los polifenoles comprenden una amplia variedad de compuestos, divididos en varias clases: ácidos hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, antocianinas, proantocianidinas, flavonoles, flavanoles, flavanones, isoflavones, estilbenoides y lignanos, que se producen en frutas y vegetales (Manach et al., 2004). Furuta et al., 1997; Gazzani et al., 1998; Hertog et al., 1992 y Vinson et al., 1998 han evaluado el potencial antioxidante de una gran variedad de vegetales. Además, Naderi et al., 2004 y Reyes Carmona et al., 2005 han reportado el potencial antioxidante de diferentes variedades de moras. 

En particular, los fenoles contribuyen sustancialmente al complemento antioxidante de muchas especies de frutos peque?os y tienen efectos potenciales sobre la salud. Extractos de varias frutas como moras, frambuesas y grosellas actúan efectivamente inhibiendo la acción de los radicales libres (Heinomen et al., 1998). 

La presencia de polifenoles en las dietas contribuye al sostenimiento de una buena salud (Rice-Evans, 2001) y juega un rol importante en la prevención de enfermedades degenerativas como el cáncer (Hertog et al., 1996). Algunos estudios han demostrado que los tratamientos térmicos por calor afectan a las vitaminas, reduciendo sus niveles en vegetales y frutos (Lii et al., 1987; Shiau et al., 1986).

Moskaug et al. (2004) describieron algunos efectos adversos cuando se suministran suplementos con altas concentraciones de flavonoides. Estas altas concentraciones producirían radicales reactivos que inducirían la autoxidación. En lo referente  a la ingesta necesaria de los polifenoles, Toivo et al. (1998) estimaron per capita una ingesta de 160-360 mg/día en EE.UU., mientras que Bryngelson et al. (1997) en Suecia  propuso una ingesta de 80 mg/día. De otra manera, es importante considerar una cantidad conveniente de antioxidante porque un exceso en el organismo produce una acción prooxidante (Palozza, 1998).

La frambuesa es un fruto estacional y su conservación por largos períodos es dificultosa. De allí la importancia de deshidratarla mediante distintos tratamientos térmicos para luego obtener una harina molida de frambuesas de baja actividad acuosa, lo que favorece su conservación. En este trabajo se investigan los efectos de los tratamientos térmicos sobre las propiedades antioxidantes de la harina de frambuesas a los efectos de poder emplearla para reforzar la capacidad antioxidante de otros alimentos. 

 

Las frambuesas (Rubus ideaus) fueron adquiridas en un supermercado de la ciudad de Rosario. Se lavaron con una solución acuosa de detergente neutro y enjuagaron con agua corriente tres veces.  

 

Reactivos. Los siguientes reactivos químicos fueron provistos por Sigma comercial Co. (St. Louis, USA): metanol; 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH*); cloruro ferroso; ferrozina; nitrito de sodio al 5%; tricloruro de aluminio; catequina; EDTA; hidróxido de sodio. Todos los reactivos químicos y solventes utilizados fueron de grado reactivo analítico.

 

Deshidratación. Las frambuesas se blanquearon con vapor seco en autoclave a 110?C durante 210 s. Posteriormente, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró para separar el jugo del resto del fruto, este último, que es el objetivo de estudio, se colocó en bolsas de polietileno de 30 micrones y se conservó a -18?C hasta su utilización. Luego los frutos fueron sometidos a tratamientos de secado de 60?C y 100?C mediante estufa con recirculación de aire y a temperatura ambiente. El descongelamiento anterior al procesado térmico se efectuó en una cámara termostatizada a 25?C (Chin-Lin et al., 2003). Los tratamientos térmicos ensayados para deshidratar el material fueron los siguientes: 

• Secado a temperatura ambiente (TA) (control o testigo); 10080 minutos

• Secado en estufa con recirculación de aire a 60?C; 555 minutos

• Secado en estufa con recirculación de aire a 100?C; 450 minutos

Las humedades finales alcanzadas para los tratamientos se?alados fueron 13.9; 14.8 y 13.8%, respectivamente. Los tiempos fueron establecidos hasta alcanzar pesada constante.

 

Preparación de los extractos. El material seco obtenido en cada tratamiento fue molido con molino de cuchillas hasta que el material pasó por tamiz malla 40, lográndose una harina de frambuesas. A partir de 5 g de la misma, mediante extracción con 25 ml de metanol durante 10 horas de agitación a temperatura ambiente y al abrigo de la luz, se difunden los flavonoides desde el sólido hacia el solvente. Luego, los sólidos son separados mediante filtración (Whatman N?40). A partir del filtrado (solución madre) se prepararon soluciones desde 0.398 a 11.95 mg de ss/ml de solvente, las que denominamos extractos. Las concentraciones de los sólidos solubles presentes en los mismos fueron determinadas tomando 5 ml de extracto colocado en un pesafiltro y secado en estufa a 60?C hasta peso constante. Los  extractos se conservaron a -18?C en frascos herméticos de vidrio hasta su utilización para realizar las determinaciones analíticas correspondientes. 

 

Test de efecto capturador de radicales libres. El método espectrofotométrico de Shimada et al. (1992) fue usado para determinar el efecto capturador de radicales libres. Se mezcló 1 ml de los extractos metanólicos de las harinas de frambuesas deshidratadas con 5 ml de una solución metanólica 0,1 mM de DPPH* recientemente preparada y se las dejó al abrigo de la luz durante 50 minutos. Luego la absorbancia se midió a 517 nm  contra un blanco de reactivos con un espectrofotómetro Jasco Modelo 7800 UV-Vis (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japón). La catequina se utilizó como especie química de referencia.  El ERCL se expresa en porcentaje, el cual puede calcularse de la siguiente forma:

%ERCL = (1- (Absorbancia de la muestra/Absorbancia del blanco de reactivos)) x100.

 

Determinación de la capacidad quelante del ión ferroso. Se la evaluó utilizando el método espectrofotométrico propuesto por Decker y Welch (1990) con modificaciones: a 1 ml del extracto metanólico se adicionaron 0.1 ml de FeCl2.4 H2O 2 mM; 0.2 ml de solución de ferrozina 5mM y 3.7 ml de metanol, se mezcló con la ayuda de un equipo vortex y se dejo progresar la reacción durante 10 minutos. La absorbancia se midió a 562 nm contra un blanco de reactivos. El EDTA se utilizó como especie química quelante de referencia. 

La CQ se expresa en porcentaje y se calcula usando la expresión:

 

Determinación del contenido de flavonoides totales. Se evaluó mediante el método de Kim y col. (2003) con algunas modificaciones. Se basa en la capacidad de los flavonoides de formar un compuesto coloreado en presencia de aluminio en medio alcalino, con máxima absorbancia a 510 nm. A 1 ml del extracto metanólico de frambuesa deshidratada se le adicionan 4 ml de agua bidestilada y 0,3 ml de nitrito de sodio, éste es considerado el tiempo cero, a los 5 min se le agregan 0,3 ml de cloruro de aluminio al 3%, a los 6 min 2 ml de hidróxido de sodio (1M) e inmediatamente 2,4 ml de agua bidestilada, midiéndose la absorbancia de la mezcla a 510 nm contra un blanco de reactivo con un espectrofotómetro Jasco Modelo 7800 UV-Vis (Japan Spectroscopic Co., Tokio, Japón). Debe destacarse que las determinaciones del CFT para cada tratamiento se efectuaron partiendo de extractos de 12 mg de ss/ml, prácticamente la máxima concentración utilizada, y los valores obtenidos se expresaron en mg de catequina equivalente (CE)/g de muestra seca.  

 

Análisis estadístico del EC50. EC50 se define como la concentración media efectiva, es decir la concentración de extracto necesaria para disminuir en 50% el valor de los parámetros en estudio, en este caso ?RL y %CQ (Navarro, A. et al., 2006). En la determinación del análisis estadístico del EC50 de los parámetros estudiados con respecto al CFT, se determinó la concentración media efectiva a cada temperatura de tratamiento de secado y luego se correlacionaron los valores del EC50 con respecto al CFT, para cada parámetro. Se empleó para cada tratamiento el valor de CFT obtenido a partir de una solución de extracto de 12 mg ss/ml. Para los tratamientos de secado a temperatura ambiente, 60 y 100?C la concentración de los extractos relacionados con los controles utilizados fue de 0.015 y 0.596 mg de ss/ml para catequina y EDTA, respectivamente. 

 

Los datos fueron procesados mediante el software estadístico Statgraphics Plus 4.1. Para establecer la existencia de diferencias significativas entre los parámetros en estudio se empleó el Test de Student. Con referencia al ?RL, a partir de la figura 1 (ver en pdf adjunto) y aplicando el test de Student se observa que hasta 0.4 mg de ss/ml prácticamente no existen diferencias significativas entre los valores del tratamiento a 60 y 100?C y el de TA; dichas diferencias se acentúan ente los dos primeros a partir de 0.70 mg de ss/ml, donde los valores a 60?C comienzan a superar a los de 100?C, y a partir de la concentración de 1.2 mg de ss/ml hasta 12 mg de ss/ml se mantienen prácticamente y superan en alrededor del 10% a los de 100?C. Por otra parte, a TA presenta diferencias significativas marcadas con respecto a los de las temperaturas de 60 y 100?C a partir de 0.7 mg de ss/m, mientras que a partir de valores cercanos a 4 mg de ss/ml y hasta 12 mg de ss/ml, los tratamientos a TA y 60?C no presentan diferencias significativas y se mantienen prácticamente oscilando entre 95.5 y 94.5%, respectivamente. De la misma manera, se hacen significativas las diferencias entre dichos tratamientos y el de 100?C, cuyo valor se mantiene en alrededor del 85.7%. 

A efectos comparativos, Chun–Hsien Lin et al. (2006), en sus investigaciones sobre propiedades antioxidantes del brócoli bajo diferentes tratamientos térmicos, encontraron que el ECRL en muestras precocidas presentó valores del 95% a partir de concentraciones de 12 mg de ms/ml.

En ese orden, Tosi et al. (2012), en orujos tintos con semilla, encontraron para el ?RL valores cercanos a 96.5 y 94%, para soluciones de extractos de 10.9 y 13.7 mg de ss/ml, respectivamente.

En  la figura 2 (ver en pdf adjunto) se exponen los resultados obtenidos del %CQ. Se deduce que entre los tratamientos a 60 y 100?C no existen prácticamente diferencias significativas en todo el rango de concentraciones utilizado, llegando a valores cercanos al 26% para 12 mg de ss/ml. Con respecto al tratamiento de las frambuesas secadas a TA (salvo para un primer tramo de concentraciones cercanas a 0.6 mg ss/ml, en el cual no existen diferencias significativas con los otros dos tratamientos) en el rango de concentraciones comprendido entre 1.8 y 8 mg de ss/ml se presentan acentuadas diferencias significativas, las que se van reduciendo a medida que se alcanzan 12 mg de ss/ml y se van haciendo menos acentuadas ente 8 y 12 mg de ss/ml. A dicha concentración para TA se alcanzan valores de 17.5%. La CQ del EDTA, en todas las concentraciones, resultó significativamente mayor a la de todos los demás extractos. A los efectos comparativos, Tosi et al (2009) determinaron para harina de moras deshidratadas los siguientes valores a 58.60 mg de ss/ml: 70.7%; 37% y 22.1% para los tratamientos a TA, 100?C y 60?C, respectivamente. 

Al observar la figura 3 (ver en pdf adjunto) debe destacarse que existen diferencias significativas del CFT entre los ensayos de la muestra en el tratamiento a TA (64.11 mg de CE/g de ms) y los tratamientos de secado a 60?C (75.02 mg CE/g de ms) y 100?C (40.71mg de CE/g de ms). El CFT a 60?C es superior a los tratamientos a TA y 100?C, además, en el tratamiento a 60?C se obtienen valores superiores al de TA en un 17%. Por otra parte, Rockenbach et al (2008), en sus estudios sobre extractos de orujos de uva a diferentes concentraciones de solvente utilizado para la extracción, obtuvieron para la variedad Ancelota los valores de 71.1 y 43.2 mg de CE/g de ms, empleando concentraciones de solvente etanólico del 70 y 100%, respectivamente. 

 

Correlaciones ente los valores del EC50 para los parámetros estudiados

Las tablas 1 y 2 (ver en pdf adjunto) representan las correlaciones entre los valores del EC50 de los parámetros ECRL y CQ con respecto al CFT para los tratamientos de secado a TA, 60 y 100?C, respectivamente. Los valores máximos alcanzados del EC50 para el ?RL y el % de la CQ se obtuvieron a TA y resultaron 0.809 y 8.82 mg ss/ml, mientras que los valores mínimos de dichos parámetros se alcanzaron en el tratamiento a 100?C, los cuales resultaron 0.337 y 0.596 mg de ss/ml, respectivamente.

Con respecto a los controles utilizados, el EC50 de las soluciones de catequina y de EDTA fueron 0.083 y de 0.596 mg ss/ml. Se observa que las regresiones polinómicas encontradas para los parámetros del ECRL y la CQ se ajustan con coeficientes de regresión de 1 para polinomios de segundo grado, siendo el término p<0.0001 para ambos casos. Pero cuando se realizan las correlaciones lineales del ECRL y la CQ, los coeficientes de regresión son de 0.41 y 0.29, respectivamente.

Los CFT relacionados con las mediciones de absorbancia en los que se realizó el estudio estadístico de EC50 para el ECRL y la CQ en los tratamientos a temperatura ambiente y 60?C produjeron los mayores valores del EC50  de 0.809-0.443 y de 8.82-1.4 mg de ss/ml, respectivamente, mientras que sus respectivos valores del ?RL y del % CQ resultaron: 0.809-47.25 y 9.95-13.1%.

 

Las condiciones de secado utilizadas para el tratamiento térmico de frambuesas inciden en el ECRL, la  CQ y el CFT de los extractos metanólicos obtenidos a partir de la harina de frambuesa deshidratada. Efectivamente, a 100?C el ECRL y el CFT se han visto afectados, ya que a esta temperatura de secado se obtuvieron los menores valores de los mismos. Evidentemente, el aumento de la temperatura de secado por encima de los 60?C ocasiona alguna modificación en la estructura química de los flavonoides presentes y probablemente produciría una disminución en general de la capacidad antioxidante de las harinas de frambuesas obtenidas. 

En todos los casos, los parámetros estudiados crecen con el aumento de las concentraciones de los extractos utilizados. Sin embargo, en primera instancia, los valores obtenidos de CQ en los extractos metanólicos de frambuesas son relativamente bajos, ocasionados probablemente por alguna modificación en la estructura de los flavonoides, producto fundamentalmente de los tratamientos térmicos que provocan alguna modificación en los grupos hidroxilo, dificultando su capacidad para quelar a los iones ferrosos. No obstante, los valores mayores se obtuvieron a partir de los extractos de las harinas obtenidas luego de los tratamientos térmicos de 60 y 100?C, respectivamente, los cuales a la concentración de extracto de 12 mg de ss/ml superaron en un 39% al tratamiento de secado a temperatura ambiente.

El CFT aparentemente se incrementa con la temperatura, pero por encima de 60?C. Cuando la misma es de 100?C decrece notoriamente  a valores cercanos a 40 mg de CE /g de ms.

Con referencia al análisis estadístico de los valores de EC50, se concluye que el % ECRL y el % de la CQ en los tratamientos a 60 y 100?C resultaron superiores al de TA, mientras que en lo referente al PR, los mayores valores se obtuvieron a 60?C y TA, en ese orden. Por lo tanto, para los parámetros estudiados consideramos oportuno se?alar que realizamos correlaciones de ajuste donde, además de la lineal, hemos incluido la regresión polinómica de segundo orden, cuando otros autores sólo consideran la regresión lineal en todos los casos (Shih-Chuan Liu et al, 2009). Por lo tanto la EC50 del %•ECRL y del % de CQ se ajustaron con correlaciones polinómicas de  n=2 con coeficientes de regresión de 1 y p<0.000. En tanto, con ajustes lineales del EC50 para dichos parámetros obtuvimos coeficientes de regresión de 0.41 y 0.29, respectivamente. 

 

Los autores agradecen a las becarias avanzadas en la carrera de Ingeniería Química Mónica Bonfigli, Guadalupe Casconi y a la Ingeniera Química María Laura Scolari Pasinato por su colaboración en el desarrollo de este trabajo.  

 

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