Optimización de una metodología SPME-GC para identificación y cuantificación de compuestos volátiles de oxidación en leche entera en polvo

El objetivo de este trabajo fue optimizar la aplicación de Microextracción en Fase Sólida (SPME) acoplada a un Cromatógrafo Gaseoso (CG) para el análisis de compuestos volátiles asociados a procesos oxidativos en leche entera en polvo. Los compuestos volátiles fueron extraídos por inmersión de la fibra de SPME en el espacio de cabeza (HS) y fueron analizados en un CG con detector de ionización de llama (FID). Doce compuestos volátiles fueron evaluados. Las variables independientes estudiadas fueron: tiempo de equilibrio (TEQ), temperatura de equilibrio (TEMP) y tiempo de extracción (TEX), cada una de las cuales se analizó en tres niveles distintos utilizando el dise?o factorial de Box-Behnken. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron: TEQ 15min. TEMP 45°C y TEX 30min. Tres tipos de fibras de SPME fueron evaluadas para extraer/concentrar los compuestos volátiles: PDMS, PDMS/CAR y CAR/PDMS/DVB aplicando las condiciones óptimas obtenidas, resultando la fibra de triple fase CAR/PDMS/DVB la que mayor sensibilidad presentó para estos compuestos.

Palabras claves: SPME, leche en polvo, oxidación.

 

 

La vida útil de la leche entera polvo es de 10 a 18 meses dependiendo de la forma de envasado (Schaller, 2001). Las variaciones en su almacenamiento son fundamentalmente de naturaleza química, dando lugar a la aparición de olores y sabores indeseables, pérdida de valor nutricional y con esto pérdida de estabilidad. Se ha establecido que la oxidación de los productos lácteos durante su almacenamiento se debe a una aceleración de la oxidación previamente inicializada en la leche cruda (Hedegaard, 2006). Estas reacciones generan compuestos volátiles que deterioran el flavor natural de la misma generando aromas que el consumidor percibe como desagradables, aún en bajas concentraciones. Estos compuestos presentan umbrales de percepción en el orden de ng/L por lo cual se necesita utilizar metodologías sensibles y específicas para su detección y cuantificación.

 

La microextracción en fase sólida (SPME) es una metodología de preparación de muestras, sencilla, rápida, económica y que no utiliza solventes. Esta técnica se emplea en el análisis de compuestos volátiles de alimentos y bebidas, entre otras aplicaciones. Una de sus principales ventajas es que puede concentrarse mientras que los compuestos son extraídos de una matriz, lo que resulta en una herramienta útil para el estudio de compuestos en concentraciones muy bajas, y más aún para las matrices complejas (Arthur y Pawliszyn, 1990). La fase de extracción no es exhaustiva y se considera completa cuando el equilibrio en la distribución característica entre el par fibra-analito de interés se cumple (Sánchez Prado, 2004). En este punto, es fundamental tener en cuenta el tiempo de equilibrio, donde la cantidad de analito extraído se mantiene constante, y la temperatura de extracción y tiempo de extracción (Hernando, 2002). También afectan el proceso el volumen de muestra y la agitación, entre otros.

 

Debido a la multiplicidad de variables que afectan el proceso de SPME, para su optimización es necesaria la aplicación de un modelo estadístico que tenga en cuenta la interacción existente entre las mismas. De esta manera, el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio en el HS estará influenciado por la temperatura a la que se lleva a cabo la extracción y por el tipo de fibra y su capacidad de absorber los analitos presentes en la matriz de las muestras.

 

La Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) es una herramienta útil para la investigación de las distintas variables que influyen en algunas de las medidas de rendimiento o calidad características del producto o proceso que se estudia. La MSR consiste en un conjunto de procedimientos matemáticos y estadísticos que pueden ser utilizados para estudiar las relaciones entre una o más respuestas (variables dependientes) y una serie de factores (variables independientes) (Diniz y Martin, 1996). La MSR tiene como propósito dise?ar un experimento que arroje valores razonables de la variable respuesta “y”, ajustando un modelo matemático que permita visualizar el efecto que proporciona cada factor o variable. La relación entre la respuesta y las variables estudiadas puede describirse en una superficie de coordenadas x1, x2, x3 ajustadas en una función matemática de primer, segundo o tercer orden. De esta manera, se busca la combinación óptima de las variables que logren la máxima respuesta (Ünal et al., 2003).

 

El objetivo de este trabajo fue optimizar la aplicación SPME acoplada con un CG para el análisis de compuestos volátiles asociados a procesos oxidativos en leche entera en polvo. 

 

 

Se utilizó leche entera en polvo comercial, reconstituida a un 13% (p/v) con agua bidestilada a 45°C. Se prepararon 12 soluciones de estándares individuales para dimetilsulfide, 2,3-butanediona, 3-CH3-butanal, pentanal, 4-CH3-2-pentanona (sti), hexanal, heptanal, trans-2-nonenal, octanal, nonanal, trans-2-hexenal y trans-2-heptenal en agua a partir del estándar puro (Fluka-Chemika; Aldrich, pureza 95 - 99,7%), la concentración final de cada una de las soluciones estándares fue de 700 ppm (mg/l). La solución de trabajo estaba compuesta por la mezcla de las 12 soluciones en una concentración final de 50 ppm de cada uno. Esta mezcla se utilizó para la adición estándar en las muestras de leche en polvo reconstituidas.

 

Se tomaron 5 ? 0,01 ml de leche y se colocaron en un vial de 10 ml de vidrio color caramelo. Posteriormente, se adicionaron los estándares a una concentración final de 50 ppb, excepto dimetilsulfide, 2,3-butanediona, nonanal y trans-2-nonenal que tuvieron una concentración final de 150 ppb. El vial fue colocado y calentado en un bloque seco (Reacti- Therm #18821, Thermo Scientific) a la temperatura correspondiente al nivel a ensayar determinado en el modelo (TEMP) durante el tiempo de equilibrio (TEQ), previo a la inserción de la fibra. La fibra de SPME fue expuesta en el HS de la muestra durante el tiempo de extracción (TEX).

 

Luego de cumplido el tiempo, se retiró la fibra del vial. El análisis de los compuestos volátiles se realizó en un cromatógrafo de gases con detector de ionización de llama(CG- FID Shimadzu 14-B). La deserción térmica de los compuestos volátiles de la fibra de SPME se realizó en el inyector del CG durante 4 min a 260?C. El inyector fue operando en el modo splitless (4 min). Los compuestos volátiles fueron separados en una columna capilar ATTM5 de 60m de longitud, 0,32 mm de diámetro interno y 1μm de espesor de film. La temperatura de la columna fue inicialmente de 40°C, mantenida durante 4 min, tiempo que duró la desorción de los compuestos de la fibra, luego se trabajó con rampa de temperatura, llegando a una temperatura final de 260?C. El tiempo total de la corrida fue de 50,38 min. La identificación de cada compuesto se realizó por medio de sus tiempos de retención

 

 

El dise?o experimental fue un dise?o factorial de Box- Behnken con tres factores y tres niveles (Box y Behnken, 1960). Los niveles sin codificar y codificados y el dise?o experimental se muestran en la Tabla 1. Para predecir los parámetros del modelo matemático se hizo un análisis de tercer orden de regresión múltiple utilizando el método de regresión cuadrática. El modelo de regresión entre las variables dependientes (y) y las variables independientes fue un polinomio (Montgomery, 1996). Los gráficos de contorno se obtuvieron fijando una variable constante en el nivel óptimo y modificando las otras dos variables dentro del rango experimental.

  

 

Tres tipos de fibra se evaluaron para extraer/concentrar los compuestos volátiles: revestimiento de Polidimetilsiloxano (PDMS – 100 μm), revestimiento de Carboxen - PDMS (CAR/PDMS -75 μm) y DVB/Carboxen/PDMS (2 cm - 50/30 μm) aplicando las condiciones óptimas determinadas previamente. Tres muestras de leche entera en polvo reconstituidas se analizaron para cada fibra a evaluar.

 

 

Todos los procedimientos se llevaron a cabo utilizando el paquete estadístico SAS (Versión 8, SAS Institute Inc., 2004, Cary, NC).

 

 

Los resultados del análisis de los compuestos volátiles de oxidación para los cuales el modelo fue significativo se muestran en la Tabla 2.

 

 

El Análisis de varianza obtenido indicó que un modelo de tercer orden fue el que mejor describió el comportamiento de cada uno de los compuestos: dimetilsulfide, hexanal (Tabla 3), trans-2-hexenal, heptanal, trans-2-heptenal, octanal y trans-2-nonenal. Estos modelos incluyen sólo aquellos términos que fueron estadísticamente significativos (p<0,05).

 

Para cualquiera de las combinaciones de las variables independientes dentro de los rangos estudiados los coeficientes de determinación R2 fueron elevados y variaron entre 0,980 y 0,999. Para seleccionar la condición óptima de las variables independientes analizadas se consideró aquella condición que lograra el valor predicho más alto y el valor óptimo obtenido del análisis de la superficie de respuesta para cada una de las variables dependientes. En esta selección el compuesto de referencia fue el hexanal ya que es uno de los compuestos volátiles común en las rutas de oxidación de la mayoría de los ácidos grasos.

 

El análisis de la superficie de respuesta para hexanal indicó que el valor máximo se encontró en la condición -1 para TEX y en la condición 1 para TEQ (Figura 1a). Por otro lado, en la condición de ensayo N° 2 se alcanzaron los valores predichos más altos para hexanal o el valor inmediato inferior en la mayoría de los otros compuestos (Tabla 2). En base a esto, teniendo en cuenta las áreas de la respuesta obtenidas, las condiciones óptimas pueden ser consideradas como TEQ = 15 min (condición 1), TEX = 30 min (condición -1) y TEMP= 45°C (condición central). Cabe mencionar que, si bien la temperatura óptima de extracción se ubicó en la condición 1, para TEX = -1 y TEQ = 1, ésta no fue una condición de ensayo contemplada en el dise?o (Figura 1 b y 1c respectivamente).

 

La temperatura de extracción (TEMP) contribuye de dos maneras absolutamente opuestas en el proceso de SPME (Tomkins y Barnard, 2002). Por un lado, los coeficientes de difusión de los analitos en la muestra aumentan a medida que incrementa la temperatura, mejorando así la extracción del analito extraído. Además, en el HS-SPME, a medida que aumenta la temperatura también lo hace la concentración de analito en la cámara de aire, haciendo la extracción más rápida. Por otro lado, un aumento de la temperatura reduce los coeficientes de distribución del analito entre la muestra y la fibra, lo que afecta negativamente a la eficiencia de la extracción (Hernando, 2002). Este efecto explicaría por qué la temperatura óptima de extracción resultó ser el valor central en el rango de prueba.

 

El tiempo de extracción en SPME es un parámetro muy importante a considerar. En el desarrollo de un método analítico basado en la SPME, el tiempo necesario para alcanzar el estado de equilibrio se debe determinar para cada par de fibra-analito, siendo este valor característico del par, y debe buscarse siempre que sea posible (Pawliszyn, 1997). El tiempo de equilibrio es aquel en el que la cantidad de analito extraído se mantiene constante (Tomkins y Barnard, 2002).

 

Una vez definidas las condiciones óptimas de las variables independientes que afectan el proceso de extracción de los compuestos, se evaluó el tipo de fibra más adecuado para el proceso de extracción. Utilizando la fibra PDMS no se obtuvieron respuestas para los compuestos estudiados. Esto puede ser debido a que es una fibra con más afinidad para compuestos no-polares. Vale la pena mencionar que las fibras con una combinación de más de un polímero son más adecuadas para la determinación de analitos volátiles, ya que, a diferencia de las fibras PDMS y Poliacrilato (PA), la principal interacción entre ésta y los analitos se da por adsorción, considerando que son polímeros sólidos (Achten y Püttmann, 2000, Martos y Pawliszyn, 1999). Los promedios obtenidos para la fibra Carboxen/ PDMS y Triple fase, así como también el resultado de la prueba t de Student se muestran en la Tabla 4.

 

 

Los valores obtenidos para Dimetilsulfide, 3-CH3-Butanal, Pentanal, Hexanal, trasn-2-Hexenal, Heptanal, trans-2-Heptenal, Octanal y Nonanal fueron significativamente mayores para el caso de la fibra DVB/Carboxen/PDMS (Tablas 4). Por lo tanto, la fibra más adecuada para la extracción de compuestos volátiles de oxidación en leche resultó ser la fibra de triple fase. Esto podría deberse a que la combinación de CAR, DVB y PDMS proporciona una mayor capacidad de extracción de moléculas de diferentes tama?os. En esta fibra, una primera capa de PDMS/CAR está cubierta por una segunda capa de PDMS/DVB. Las moléculas más peque?as con mayores coeficientes de difusión llegan a la capa interna más rápido y son absorbidos por la capa

Carboxen. Las moléculas más pesadas se mantienen en la capa externa DVB (Pillonel y col., 2002).

 

 

Se optimizó la metodología de extracción y concentración por HS-SPME-GC de compuestos volátiles asociados a procesos de oxidación en leche entera en polvo. Se determinó que la condición óptima (valores máximos de detección) se logró cuando las muestras son procesadas con un tiempo de equilibrio de 15 min, a una temperatura del bloque termostatizado de 45°C, prosiguiendo con un tiempo de extracción de 30 min, y utilizando una fibra para SPME triple fase (DVB/CAR/PDMS).

El proceso de detección aumentó significativamente su sensibilidad ante los compuestos estudiados con respecto a la combinación de variables independientes que se utilizaban previos a la optimización (condiciones centrales), ya que los valores de detección correspondientes a algunos compuestos fueron hasta tres veces mayores, a la misma temperatura y en menor tiempo, que los obtenidos con las condiciones centrales.

 

Nomenclatura

CAR = Carboxen.

CG = Cromatografía Gaseosa.

DS = Desvío Estándar.

DVB= Divinilbenceno.

FID = Flame Ionization Detector

HS = Espacio de Cabeza.

L = Coeficiente Lineal.

CM = Cuadrado Medio.

MSR = Metodología de Superficie de Respuesta.

PA = Poliacrilato.

PDMS = Polidimetilsiloxano.

Q = Coeficiente Cuadrático.

SPME = Microextracción en fase sólida.

TEMP = temperatura (°C).

TEQ = tiempo de equilibrio (min.)

TEX = tiempo de extracción (min.).

 

 

Los autores agradecen a la Sra. Patricia Benedetti por su colaboración en los análisis cromatográficos.