Proteolisis en queso Reggianito madurado con diferentes combinaciones de temperatura/tiempo

Autor: R.J. Ceruti; S.E. Zorrilla; G.A. Sihufe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Quimica (INTEC). Santa Fe, Argentina. rceruti@santafe-conicet.gov.ar

Introducción
De todas las etapas de elaboración de un queso, la de maduración suele ser la de mayor duración y la más importante en cuanto a su efecto sobre los atributos finales de flavor, apariencia y textura, ya que es durante esta etapa que ocurren las transformaciones físicas, químicas y bioquímicas responsables de dichas características. Entre estas transformaciones, la proteólisis es la más compleja y, para muchas variedades de queso, también la más importante. Suele diferenciarse una primera etapa de proteólisis primaria, en la que las caseínas mayoritarias son degradadas a péptidos de alto y mediano peso molecular, generalmente como resultado de la acción del coagulante residual y de la plasmina; y una segunda etapa de proteólisis secundaria, en la que ocurre la subsecuente degradación de estos péptidos, debido fundamentalmente a la acción de proteasas y peptidasas provenientes de los distintos microorganismos presentes en el queso. Los aminoácidos y péptidos peque?os liberados son a su vez catabolizados por estos microorganismos (McSweeney y Sousa, 2000).
    El efecto de la proteólisis en su conjunto sobre las propiedades finales del queso es de gran relevancia. Con respecto a la textura, se observa un fenómeno de ablandamiento o softening, debido en parte a la hidrólisis de la matriz proteica y en parte a la disminución de la actividad acuosa. Con respecto a las características de flavor, los efectos que se observan se deben por un lado al aporte directo de algunos péptidos peque?os y aminoácidos. Por otro lado, los aminoácidos libres son los sustratos de reacciones metabólicas posteriores que generan muchos de los compuestos que contribuyen al aroma y sabor del producto madurado (McSweeney, 2004).
    Entre las principales estrategias que se han desarrollado para acelerar la maduración de quesos, el uso de altas temperaturas de almacenamiento es la más simple y además de ser muy efectiva, está relacionada con los beneficios de bajar el consumo energético por refrigeración, lo que conduce a un ahorro neto en los costos globales de la producción quesera (Hannon y col., 2005). Sin embargo, si se tienen en cuenta las numerosas reacciones bioquímicas que tienen lugar durante la maduración, puede ocurrir que no todos los procesos sean igualmente acelerados a estas temperaturas, pudiéndose generar un flavor desbalanceado o la aparición de off-flavors (Folkertsma y col., 1996).
    El Reggianito es uno de los quesos argentinos mejor conocidos en el exterior. Se trata de un queso que encuentra entre sus antecedentes a los quesos duros italianos, Parmiggiano Reggiano y Grana Padano, aunque el Reggianito ya ha adquirido sus características propias (Zalazar y col., 1999). Se trata de un queso habitualmente madurado por un período mínimo de seis meses a temperaturas comprendidas entre 11-13°C y 82-85% de humedad relativa. En distintos estudios se ha evaluado el efecto de madurar quesos Reggianito a una temperatura de 18°C durante seis meses sobre la lipólisis (Sihufe y col., 2007), la proteólisis (Sihufe y col., 2010a) y las características sensoriales (Sihufe y col., 2010b) y se ha realizado un análisis estadístico global para relacionar estos resultados (Sihufe y col., 2010c). Además de permitir caracterizar las principales transformaciones que ocurren durante la maduración, estos estudios sirvieron para comprobar que es posible acortar el tiempo de maduración de queso Reggianito por aumento de la temperatura de maduración y para establecer que el período óptimo de almacenamiento de este queso a 18oC se encontraría entre dos y tres meses.
    A diferencia de los estudios mencionados (en los cuales fundamentalmente se ha evaluado la aplicación de temperaturas elevadas durante todo el período de almacenamiento de los quesos) y teniendo en cuenta lo recomendado por otros autores (Aston y col., 1983; Fedrick y col., 1983; Ferrazza y col., 2004; O´Mahony y col., 2006), la aplicación de temperaturas elevadas sólo durante la primera etapa de la maduración aparece como una opción interesante, para luego seguir madurando a la temperatura convencional. Esto conduciría a un aumento moderado y equilibrado en la actividad de los sistemas enzimáticos, reduciendo el riesgo de contaminación microbiológica y el posible desbalance en las reacciones bioquímicas por aumento prolongado en la temperatura de almacenamiento de los quesos. Por lo tanto, en el presente trabajo se analizó el efecto del uso de diferentes combinaciones temperatura/tiempo sobre la proteólisis primaria y sobre algunos parámetros fisicoquímicos característicos del queso Reggianito.

 

Materiales y métodos
Se emplearon 20 quesos (7,8 ? 0,1 kg de peso; 23,7 ? 0,2 cm de diámetro y 15,3 ? 0,2 cm de altura) provenientes de una industria de la zona. Dos de ellos se utilizaron para determinar las condiciones iniciales y otros seis fueron almacenados de la manera tradicional (12oC y 85% HR durante seis meses), los cuales fueron identificados como quesos control (C). Los doce quesos restantes fueron almacenados en dos condiciones experimentales diferentes: seis quesos se almacenaron a 20oC y 85% HR durante los primeros 15 días y luego hasta seis meses a 12oC y 85% HR (quesos E1); los otros seis quesos se almacenaron a 20oC y 85% HR los primeros 30 días y luego hasta seis meses a 12oC y 85% HR (quesos E2).
    Se obtuvieron muestras por duplicado de la parte central del queso a los 61, 124 y 180 días de maduración. Se determinaron los contenidos de humedad y cloruro (Zorrilla y Rubiolo, 1994), nitrógeno total (NT) y nitrógeno soluble en agua a pH 4,6 (NFS, Sihufe y col., 2003), y el pH se determinó con un electrodo para alimentos sólidos (pH Spear, Oakton Instruments, Vernon Hills, IL, USA). El índice de maduración (IM) fue expresado como la relación porcentual del NFS respecto del NT.
    Para el análisis electroforético, se disolvieron 3 g de queso en 25 mL de una solución de urea 8,66 M. Posteriormente, la grasa fue eliminada por filtración en frío. La degradación de las caseínas se evaluó por urea-PAGE del extracto obtenido, según la metodología propuesta por Sihufe y col. (2010a).
    Para el análisis estadístico se efectuó un ANOVA tomando como factores el tiempo de maduración, el tratamiento temperatura/tiempo y su interacción. Cuando las diferencias entre los factores fueron significativas (p<0,05), se hizo una comparación múltiple de medias usando el test de LSD. Se utilizó el software Statgraphics Plus for Windows v. 2.1 (Statistical Graphics Corp., Rockville, MD, USA).

 

Resultados y discusión
Los parámetros fisicoquímicos iniciales correspondientes a los quesos en estudio fueron: 40,1 ? 0,2% de humedad; 20,8 ? 1,5% de materia grasa; 4,9 ? 0,4% de IM y 5,24 ? 0,02 de pH; mientras que el contenido de cloruro resultó no detectable. En la tabla 1 se informan los valores medios de pH, contenido de cloruro y humedad y el IM para cada tratamiento durante el período de maduración estudiado. Se observaron valores de pH que variaron levemente y permanecieron en valores adecuados durante todo el período, lo cual resulta una medida de control eficiente para descartar contaminación con microorganimos no habituales (por ejemplo, contaminación por hongos).
    Los valores finales de contenido de humedad y cloruro fueron similares para todos los quesos, de aproximadamente 36% y 1%, respectivamente. Estos valores resultaron semejantes a los informados en otros estudios sobre queso Reggianito (Candioti y col., 2002; Sihufe y col., 2007; Wolf y col., 2010). Los tratamientos evaluados modificaron levemente los perfiles de redistribución de sal y de agua al comienzo de la maduración, aunque se observó un comportamiento característico de quesos salados por inmersión en salmuera y madurados sin envoltura (Simal y col., 2001).
    Se observó un aumento significativo del IM con el tiempo y con el tratamiento, siendo los valores de IM notablemente mayores para los quesos experimentales (E1 y E2) que para los quesos control (C) para un mismo tiempo de maduración.

 
En este sentido, los valores de IM para los quesos E1 y E2 a los 124 días fueron similares al de los quesos control a los 180 días. Es decir, los quesos experimentales tendrían a los 124 días un nivel de nitrógeno soluble similar al de un queso control a los 180 días de maduración (Tabla 1).
    A través del ensayo de urea-PAGE fue posible identificar y cuantificar cinco fracciones caseínicas con movilidades electroforéticas distintas (Figura 1). En la tabla 2 se observan los valores de densidad óptica integrada (IOD) para las fracciones analizadas, informados como la relación del valor de IOD respecto del valor de IOD inicial correspondiente a cada fracción. De esta manera, valores menores que 1 indican una disminución y valores mayores que 1 indican un aumento en cada fracción respecto del valor inicial.
    Las fracciones caseínicas mayoritarias (αS1- y β-caseína) disminuyeron a medida que aumentó el tiempo de maduración, especialmente durante los primeros 124 días de almacenamiento (Figuras 1 y 2). En el caso de la αS1-caseína, la disminución que ocurre durante los primeros dos meses fue acompa?ada de un incremento de las fracciones αS1-I y F3, que son de menor peso molecular y se originan como consecuencia de la hidrólisis de aquella. El tratamiento afectó significativamente la degradación de αS1- caseína, observándose mayor degradación de la proteína en los quesos experimentales que en los control y a su vez mayor degradación en los quesos E2 que en los E1 a igual tiempo de almacenamiento. Además, a los 124 días, hubo una degradación mayor (para los quesos E2) o similar (para los quesos E1) de dicha fracción con respecto a la observada en los quesos C hacia el final del periodo estudiado. A los 61 días para el tratamiento E2, la disminución de la αS1-caseína incluso ha sido mas importante (>70%) que la observada en los quesos C a los 180 días.

 

 

    En general, los niveles de αS1-I-caseína aumentaron de forma importante al comienzo del período estudiado, para luego disminuir con el tiempo de maduración. Este comportamiento puede explicarse teniendo en cuenta que la αS1-I-caseína es el fragmento (f24-199) proveniente de la degradación de la αS1-caseína, pero a su vez es susceptible de ser degradada por las enzimas presentes, dando fragmentos menores (Fox y McSweeney, 1996). A partir de los 124 días de maduración, se observó una mayor degradación de la αS1-I-caseína para los quesos experimentales (fundamentalmente para los E2), lo cual sugiere una mayor liberación de péptidos de menor peso molecular que servirán como sustrato en reacciones posteriores.
    La disminución de la β-caseína resultó en un importante aumento en las γ-caseínas, las cuales son producidas a partir de ésta por la acción de la plasmina (Fox y McSweeney, 1996). Los niveles de degradación de β-caseína también fueron afectados de forma significativa por el tratamiento, siendo estos más notables en los quesos experimentales que en quesos control, sin diferencias significativas en los valores para E1 y E2.
    Similarmente a lo observado para la αS1-caseína, el nivel de degradación de la proteína a los 61 o 124 días en quesos experimentales fue comparable a los niveles observados para los quesos control a los 124 o 180 días, respectivamente.
    Finalmente, se observó un aumento significativo de la γ-caseína durante los primeros 61 días del período de almacenamiento de los quesos, manteniéndose luego hasta los 180 días prácticamente sin cambios. Los quesos E2 mostraron valores de γ-caseína significativamente mayores que los quesos control a los 61 días de maduración, mientras que no hubo diferencias significativas entre los tres tratamientos para el resto del período evaluado.

Conclusiones
Los tratamientos aplicados no han producido alteraciones importantes en la evolución de los parámetros fisicoquímicos característicos para este queso, como pH y contenidos de humedad y de cloruro. El uso de temperaturas elevadas de 20oC durante las primeras dos o cuatro semanas de almacenamiento tiene como resultado una aceleración neta de la  proteólisis primaria en queso Reggianito, lo cual fue claramente observado a través de los perfiles de IM y de las fracciones caseínicas analizadas por urea-PAGE. Estos resultados podrían contribuir a proponer estrategias eficientes y viables para acortar el período de almacenamiento de este queso duro tradicional argentino, para lo cual resulta necesario complementar estos estudios con aquellos que involucren otros aspectos de la maduración de queso Reggianito.

 

 

 

Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad Nacional del Litoral, al CONICET y a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por el financiamiento recibido, y a la firma Milkaut S.A. por el suministro de los quesos.

Referencias
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