26/09/2011

Determinación de los niveles del carbamato de etilo en bebidas que usan bacterias lácticas además de levaduras

Autor: Scollo D.; Vicente F.; Giraudo, M.; Mora V., Kulhawik D.

Resumen
El uso conjunto de levaduras y bacterias lácticas mejora el flavor de las bebidas alcohólicas. Con el objetivo de estudiar el comportamiento de levaduras y bacterias lácticas en la fermentación simultánea de bebidas con respecto a la producción del metabolito tóxico carbamato de etilo (CE), se eligió al vino de arroz (sake) como objeto de estudio. La metodología utilizada es la descripta por la técnica oficial AOAC 28.1.48 (2007). Los valores obtenidos de CE se hallan dentro de los límites permitidos por las normativas internacionales. Los parámetros observados en la validación del método están dentro de los esperados para metabolitos en muy bajas concentraciones y muestras biológicas. El método químico de dosaje de carbamato de etilo utilizado puede ser aplicado a todas las bebidas fermentadas y fermentadas-destiladas. Se propone como método para ser incluido en el CAA, que hasta hoy carece de esta especificación, a fin de cumplir con los requerimientos técnicos de otros países y de esta manera incluir su indicación en el protocolo de los productos de empresas productoras de bebidas.

Palabras clave: uretanos, sake, cromatografía gas, MSD

Introducción
El vino sake es, dentro de la bibliografía consultada, un producto que utiliza en su obtención tanto levaduras como bacterias lácticas que modifican la composición de su flavor. La fermentación que ocurre es simultánea, con la presencia de ambos microorganismos además de hongos del género Aspergillus usados como fuente de enzimas amilásicas. La fermentación del sake transcurre en diferentes etapas: en una de ellas se agregan los hongos filamentosos y posteriormente se incorporan las levaduras y bacterias nativas.

El sake, al igual que la salsa de soja, contiene el metabolito tóxico carbamato de etilo (CE) en distintas concentraciones (Ough, 1976; Conacher et al., 1987). Durante la fermentación, en la fase de crecimiento aeróbico de la levadura, el aminoácido arginina presente en el mosto se halla en una concentración entre 0,1-2,4 g/L y puede llegar hasta los 10 g/L durante la fermentación. Al final de la misma, su valor es el mismo que el inicial. Dicho aminoácido, uno de los más importantes, es transformado por el microorganismo en citrulina, que se acumula dentro de la levadura. Ello se realiza tomando el nitrógeno imínico de la arginina que, por acción de una transaminasa, se cambia por un carbonilo (citrulina). Una vez alcanzada la concentración crítica, este último compuesto es liberado. Allí, las bacterias ácido lácticas lo hidrolizan formando ácido carbámico que pasa al medio y en presencia del alcohol producido origina el carbamato de etilo (Ough et al., 1988; Monteiro et al., 1989; Teymo-Larsson, 1989; Ough et al., 1990; Liu y Pilone, 1998). Estos últimos autores han demostrado que el Leuconostoc oeni y la cepa CUC-3 del Lactobacillus buchneri son capaces de transformar del 7 al 28% de la arginina presente en citrulina, con la aclaración de que el segundo microorganismo reutiliza la citrulina excretada. Se debe recordar además que las levaduras contienen de un 23-25% (MS) de aminoácidos totales, destacándose arginina con un 2,30% (MS).

Debido a su toxicidad, a partir de 1988 en Estados Unidos es obligatorio determinar el nivel de CE presente en las bebidas fermentadas. El mismo no debe sobrepasar el límite de 15 ppb (FDA) y 30 ppb (OMS), mientras que en lasbebidas fermentadas y destiladas su valor no debe ser superior a 125 ppb (Segal, 1988). En el a?o 2006 la compa?ía First Venture Technologies anunció que logró modificar genéticamente las levaduras buscando reducir drásticamente el contenido de CE en las bebidas fermentadas, por ejemplo un 89% en el vino tinto. Existe el CE también en otros alimentos, por ejemplo en el pan en 2 ppb (Haddon, 1994) y en salsa de soja, donde se han encontrado hasta 20 ppb (Matsudo et al., 1993)

Para la determinación analítica del CE se han propuesto varias metodologías, todas ellas con el uso de GC por el carácter volátil del analito (Conacher, 1987; Fauhl Ferreira, 1992; Jagerdeo, 2002; método oficial AOAC 994.07; Flamini y Panighel, 2006). No existen referencias bibliográficas de esta determinación en las bebidas fermentadas y fermentadas y destiladas argentinas. Se presenta por lo tanto la determinación del CE en sakes obtenidos en nuestros laboratorios a partir de la generación de koji y moto usando dos tipos de hongos Aspergillus oryzae y Aspergillus awamori, una bacteria láctica y dos levaduras en todas las combinaciones posibles.

Materiales y métodos
Cromatógrafo gas marca Thermo modelo Trace GC Ultra, acoplado a detector másico Thermo modelo DSQ-2.
Columna microbore BPX 70 de SGE, conteniendo 79% de ciano-propilpolifenilsiloxano, de carácter polar. Su longitud es de 30 metros x 0,25 mm de diámetro interno y 0,25 ?m de espesor del film (fase estacionaria). Siguiendo las especificaciones del método oficial AOAC, el CE tiene un tiempo de retención aproximadamente a los 15 minutos mientras que el estándar interno carbamato de propilo está aproximadamente a los 20 minutos.

Columnas spe de 50 mL Chem Elut de Varian, con un diámetro de partícula de 80-100 mesh (88%), 0,03-0,08 mesh (0,05%) presentando una saturación del agua absorbida en el rango 245-405%.
Los estándares de carbamato de etilo o uretano y carbamato de propilo son Sigma y tienen una pureza mínima del 99% respectivamente (TLC y GC).

Obtención de sake: el primer paso es obtener el "koji" o medio de desarrollo de los hongos. A 500 gramos de arroz entero pulido se le agregaron 1,5 litros de agua. Después de esterilizar la mezcla a 121?C durante 15 minutos se inoculó con 2 mL de una suspensión de esporas de cada hongo. La suspensión se obtuvo a partir de microorganismos cultivados en estrías en tubo de ensayo que contenían el medio de cultivo propicio para los Aspergillus en pico de flauta. Se recuperaron las esporas con 10 mL de agua estéril. Se dejaron crecer los hongos a temperatura ambiente durante un mes hasta que el sólido licuó. El segundo paso fue la obtención del "moto": se prepararon cuatro muestras idénticas a partir de 250 gramos de harina de arroz comercial con el agregado de 1200 mL de agua. Se autoclavó durante 15 minutos a 121?C. Una vez obtenida la temperatura ambiente, se inoculó con una muestra de koji de 100 mL de Aspergillus awamori o Aspergillus oryzae, con 20 mL de levadura Saccharomyces sake y 10 mL de una suspensión de bacterias ácido lácticas específicas para sake. Se obtuvieron cuatro diferentes muestras de 1,25 litros cada una.

En una segunda experiencia se prepararon nuestras de sake vino y alcohol de sake: en el primer caso se realizó la misma obtención de sake vino descripta previamente, determinando el contenido alcohólico en 11% v/v. En el segundo caso se siguió el mismo procedimiento que para vino, con destilación final hasta obtener 70% v/v de etanol. Se hace notar que dicho alcohol no fue rectificado.

Preparación de las muestras de sake para su análisis: como el contenido alcohólico del sake es inferior a 14% v/v, se tomó 20 mL de cada una de las muestras para prepararla según la técnica oficial del AOAC Método 28.1.48. En el caso del alcohol de sake se tomó una alícuota de 5 mL.

Resultados
La concentración de CE presente en las muestras de sake vino fue (n=3) de 5 a 15 ppb.
En el caso de alcohol de sake se obtuvo una dispersión de 12 a 55 ppb, lo que representa valores que se hallan dentro de los fijados por el método AOAC (10-350 ppb). En la figura 1 se observan los cromatogramas obtenidos para el estándar y la muestra.

Validación del método
Estudios de recuperabilidad. A una muestra de cada hongo se le adicionó, antes de pasar por la columna spe, 0,1-10 ppm de carbamato de etilo estándar para estudiar la exactitud (recuperabilidad del método) del procedimiento de purificación con spe. Consultando la bibliografía (Ough), confirmamos que la recuperabilidad del método es variable y está en valores comprendidos entre 43 y 122%, derivado de la baja concentración del analito. Nuestros resultados son similares.

Linealidad. Inyecciones repetidas (3) de los estándares fueron realizadas en el rango de 10-1000 ppb, obteniéndose un coeficiente de correlación de 0,9998.

Especificidad. Fueron inyectadas al GC repetidas veces (3) blancos de estándar, verificándose la ausencia de picos cromatográficos en los 30 minutos de desarrollo cromatográfico.

Exactitud (ensayo de recuperabilidad). Se realizaron agregados del estándar CE dentro del rango 10-1000 ppb. En todos los casos, la recuperabilidad estuvo dentro de los valores 50-105% (valores no mostrados) que coinciden con la gran variabilidad que se obtiene en ese rango de concentraciones bajas.

Precisión. El estudio de la precisión del método no fue realizado y sólo se consideraron los aspectos de la validación de la metodología analítica que fija el AOAC, Methods of analysis.

Sensibilidad. Determinada a partir del cálculo de la pendiente de la curva de calibración. El límite de detección fue fijado en 5 ppb y el límite de cuantificación en 10 ppb.

Verificación absoluta. Se realizó con el estándar y con las muestras analizadas. Para el estándar Sigma, el espectro másico característico obtenido por impacto electrónico a 70 eV y comparado con una biblioteca NIST, mostró fragmentos iónicos (picos más significativos) a 62 amu (M-C2H3.)+ y abundancia relativa 100%; 74 (M-CH3.)+ y 13% de abundancia relativa; 44 amu (M-C2H5.)+ y 90% de abundancia; 89 (M.ion molecular) no se observa. Las muestras analizadas también mostraron los mismos picos que los estándares con los m/z antes definidos. También coincidieron los tiempos de retención obtenidos entre el estándar y el CE presente en las muestras analizadas. Hacemos notar que no se realizó una ionización química.

Conclusiones
Los valores encontrados de CE en las muestras de sake obtenidas en nuestros laboratorios fueron similares a los permitidos en Estados Unidos en vinos. En el Código Alimentario Argentino (CAA) no hay información al respecto, pero sí la hay en la FDA y OMS (Uturri, 2007).

Se comprobó que las levaduras y las bacterias lácticas seleccionadas en nuestro laboratorio para la obtención de sake dieron valores de CE dentro de los límites fijados por la legislación internacional.
Este estudio deberá ampliarse a los vinos argentinos y a las bebidas fermentadas y destiladas que utilizan en su proceso productivo levaduras y bacterias lácticas para así contribuir a la reglamentación del CE en el CAA. Y también contribuir a que los proveedores de levaduras y bacterias lácticas usadas en vinos puedan informar acerca de si dichos microorganismos tienen la capacidad de producir cantidades limitadas de CE.

Como los valores obtenidos de CE son similares para los Aspergillus y las levaduras usadas en distintas combinaciones, se seleccionaron en la elaboración de las bebidas aquellos cultivos que dieron los mejores caracteres organolépticos al producto final. En el caso del alcohol de sake, los valores de CE pueden ser reducidos aún más rectificando el alcohol.

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